Introducción
Las primeras enfermedades bacterianas en insectos fueron reportadas en 1870 por Pasteur. En 1911 d"Herelle presentó el primer estudio de bacterias entomopatógenas en locústidos en México y aisló un pequeño bacilo, al cual dio el nombre de Coccobacillus acridorium. Desde 1921, se informó la presencia de "infecciones lechosas" en el escarabajo japonés Popillia japonica; en 1940 determinaron que los agentes causantes eran Bacillus popilliae y B. lentimorbus, y aunque se encontraron otras especies, éstas resultaron las más importantes junto con Serratia marcenses, causante de la muerte de varios grupos de insectos.

En 1901 Ishiwata informó la presencia de una bacteria cristalífera que causaba la enfermedad y muerte de larvas de algunos insectos. Diez años después, Berliner en Thuringuia, Alemania, determinó que un bacilo esporulante y cristalífero, al cual denominó Bacillus thuringiensis (Bt), era el causante de la muerte de larvas de Anagasta khuniella. B. thuringiensis presenta un cristal parasporal de forma bipirarnidal, romboide, cuadrado o amorfo, de naturaleza proteínica que es el responsable de la capacidad insecticida; su toxicidad es muy variada y depende del tipo de cristal.

El mecanismo de acción de esta bacteria es por ingestión y producto del pH alcalino del intestino del insecto, el cristal parasporal libera la toxina, la cual se asocia a puntos específicos de la membrana intestinal, formando poros que rompen la pared, a través de la cual ocurre una alteración del balance iónico, que lleva a la parálisis intestinal y cese de la alimentación. Posteriormente, y producto de una septicemia provocada por la multiplicación de la bacteria ocurre la muerte de las larvas, las cuales se toman flácidas y con un exudado lechoso; estas larvas pueden posteriormente desintegrarse. B. thuringiensis resulta tóxico a varios órdenes de insectos, ácaros e incluso nematodos.

Aunque varios grupos de bacterias han sido descritos como patógenas a insectos, sólo B. thuringiensis ha sido estudiada y utilizada ampliamente, por lo cual constituye una alternativa para el control de plagas. Los insecticidas derivados de esta bacteria constituyen el ejemplo más importante de este tipo de productos y ocupan la mayor parte del mercado mundial de bioinsecticidas. Estos productos se han utilizado comercialmente por más de 35 años y han sido aceptados como productos biodegradables y seguros para los vertebrados y el ambiente.

Sin embargo, la posibilidad de producir y aplicar productos bacterianos a gran escala fue posible hasta después de la Segunda Guerra Mundial, cuando se produjo en Francia el primer producto comercial a partir de B. thuringiensis llamado Sporiene.

Características y clasificación
B. thuringiensis pertenece a la familia Bacillaceae, y presenta células vegetativas en forma de bastoncillos más o menos largos, agrupados en cadenas de 2 a 3 células. Son Gram +, aerobias y esporógenas, durante su cultivo y asociadas a la formación de esporas, se forman cuerpos parasporales en forma de cristales que tienen efecto insecticida y se conocen como delta endotoxinas.

Para la clasificación de esta especie se han usado varios métodos. Los primeros se basaron en la caracterización morfológica y bioquímica, utilizando técnicas convencionales. Más tarde se desarrollaron esquemas de clasificación basados en el análisis serológico de antígenos flagelares (antígeno H) de células vegetativas. Se introdujo además el criterio de patrones electroforéticos de esteras as y de patrones plasmídicos dada la presencia de plásmidos como portadores de los genes que codifican para la toxinas cristalíferas.

El análisis de ácidos grasos se ha utilizado para la separación de cepas. Al final, la gen ética molecular permitió la clasificación de B. thuringiensis, ya que se demostró que los genes que codifican para la toxina cristal, los cuales están localizados en plásmidos, tienen una correlación estrecha con la toxicidad fenotípica. La clasificación por antígenos flagelares aún es útil, y hasta el momento se han logrado identificar 55 serotipos. Esta clasificación no permite correlacionar la cepa con la actividad patogénica, la cual está determinada por el tipo de delta endotoxina. La clasificación basada en los genes que codifican estas toxinas, a los cuales se denominan genes CRY, están basados en cinco grupos fundamentales, de los cuales se han caracterizado varias decenas de subgrupos que permiten establecer una correlación con la actividad insecticida.

Toxinas de B. thuringiensis
Heimpel en 1967, consideró tres exotoxinas y una endotoxina, esta última es la principal responsable del efecto insecticida. Entre las exotoxinas la más importante es la beta, conocida también como thuringensin, seguidas en importancia por la alfa y la gamma.

Existen diferentes tipos de delta endotoxinas y, cada una de ellas se asocia a un grupo determinado de insectos. Sus pesos moleculares varían entre 72 y 135 Kdaltons y su composición es proteínica, por lo cual se desnaturalizan por el calor y son solubles en condiciones alcalinas.

Las beta exotoxinas son solubles en agua, termoestables y dializables; su estructura química es un derivado fosforilado del nucleótido de adenina. Se han encontrado varios tipos de beta exotoxinas y a diferencia de las delta, éstas no son producidas por todas las cepas de B. thuringiensis. Su producción se asocia con algunos serotipos como H1, H4, H8, H9 y H10.

Las exotoxinas alfa y gamma se consideran fosfolipasas C y lecitinasa, respectivamente.

En relación a la toxicidad, la delta se considera no tóxica; sin embargo, algunas investigaciones señalan que las beta pueden tener efectos citotóxicos a determinadas concentraciones, por lo cual el empleo de productos de B. thuringiensis a partir de cepas que producen este tipo de toxina están sujetos a regulaciones adicionales.

Recientemente, se ha descrito un cristal proteínico más pequeño, de peso molecular de 28 Daltons, que no está relacionado con los genes CRY y presenta baja toxicidad a mosquitos y sólo lo producen las variedades morrisoni, israelensis, darmstadiensis, kyushiensis; el gen Cyt la codifica.

Las delta endotoxinas se producen en forma de cuerpos de inclusión o cristales paraesporales y forman una familia de proteínas cuyos miembros pueden ser tóxicos contra diversos grupos de invertebrados: seis ordenes de insectos, nematodos, ácaros, platelmintos y protozoos.

Principales grupos de genes Cry en B. thuringiensis
Cry I Lepidópteros
Cry II Lepidópteros y Dípteros
Cry III Coleópteros
Cry IV Dípteros
Cry V Lepidópteros y coleópteros.

En 1989, Hofte y Whiteley propusieron una nomenclatura y clasificación de las proteínas Cry basados en la similitud de su secuencia de aminoacidos y el rango de especificidad. En esos años, las proteínas Cry I, Cry II, Cry III, Cry IV eran las específicas contra lepidópteros, lepidópteros-dípteros, coleópteros y dípteros, respectivamente. Las clases V y VI, activas contra nematodos, fueron consideradas posteriormente en la clasificación por Feitelson y colaboradores en 1992. En 1998, Schnepf y colaboradores propusieron una nueva clasificación basada solamente en la similitud de secuencias primaria entre las proteínas Cry.

La nomenclatura actual de las toxinas Cry las agrupa como: 1. proteínas tóxicas a lepidópteros grupos Cry1, Cry2 y Cry9; 2. toxinas activas contra coleópteros grupos Cry3, Cry7 y Cry8; 3. proteínas con actividad dual grupos Cry1B y Cry1I; 4. proteínas con actividad nematicida, grupos Cry5, Cry12, Cry13 y Cry14; 5. proteínas tóxicas a dípteros, grupos Cry2, Cry4, Cry10, Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 y las Cyt.

La búsqueda y caracterización de nuevos genes cry continúa siendo un proyecto de interés mundial, porque este conocimiento proporciona nuevas alternativas para el control de las diversas plagas y quizás contribuiría a solucionar el problema del desarrollo de resistencia por parte del insecto. Estos estudios han estimulado el desarrollo de técnicas moleculares para caracterizar de manera fácil y rápida los genes cry presentes en los aislamientos de B. thuringiensis. Las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) han sido las más utilizadas en los últimos años, permitiendo la determinación precisa de los genes cry. La identificación de genes cry conocidos en las cepas de B. thuringiensis es muy importante porque pueden contribuir a la selección de nuevos aislamientos ya la determinación de la especificidad de los nuevos aislamientos. La Beta exotoxina se produce durante la fase de crecimiento exponencial por algunas variedades de B. thuringiensis. Esta fue descubierta por Cantwell y colaboradores al inyectar el sobrenadante esterilizado de un cultivo de B. thuringiensis en el hemocele del último instar larvario de Galleria mellonella. Su aislamiento y caracterización fue realizado por De Barjac y Dedonder entre 1965 y 1968 y en estudios posteriores utilizando resonancia magnética nuclear se corroboró su peso molecular aproximado de 700 Da y su estructura química, la cual fue definida como un derivado nucleotídico de adenina unido por una molécula de glucosa a un ácido fosfoalárico. Una característica de este compuesto sobre la base de su estructura química es su espectro de absorción ultravioleta, el cual presenta una absorción máxima a 260 nm y una absorbancia mínima a 230 nm.

A las Beta exotoxinas se les atribuye acción biológica contra diferentes grupos de organismos entre los que se encuentran coleópteros, ácaros y nematodos. Se han informado efectos genotóxicos de estas toxinas; sin embargo, estudios posteriores muestran que el grado de genotoxicidad no es igual para todas las Beta exotoxinas. Existen diversos métodos de detección para este compuesto, pero la mayoría son complejos y requieren siete días como mínimo para obtener resultados, como en el caso de los bioensayos con larvas de Musca domestica L. Esto hace necesario encontrar métodos sencillos de detección de esta toxina, lo cual sería de gran utilidad en los programas de caracterización de cepas de B. thuringiensis, así como para el registro de cepas de importancia comercial.

Las toxinas Vip descritas recientemente por Estruch y colaboradores se producen durante la fase de crecimiento logarítmico vegetativo, antes y durante la esporulación por algunas cepas de B. thuringiensis. Esta proteína muestra toxicidad hacia una amplia variedad de lepidópteros plaga, entre los que se encuentran Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, S. exigua y Helicoperva zea. Estas toxinas Vips no presentan homología con las toxinas Cry y Cyt conocidas. La localización de los genes que las codifican en el genoma de B. thuringiensis aún no se ha determinado, pero se considera que se encuentran en los mismos plásmidos que contienen los genes de las proteínas Cry. La proteína Vip3A puede ser detectada 15 h después del inicio del cultivo, y alcanza su nivel máximo durante las etapas tempranas de la fase estacionaria y sus niveles permanecen altos durante y después de la esporulación. Se considera que pueden estar asociadas a algunos efectos patogénicos que en ocasiones no corresponden con los patrones de genes cry presentes en un determinado aislamiento. Las propiedades biológicas y moleculares de las proteínas Vip han mostrado un nuevo agente insecticida que podría complementar y ampliar el uso de las toxinas derivadas de B. thuringiensis.

Mecanismos de acción
Como se mencionó, estas toxinas deben ser ingeridas por el insecto sensible, cuyo intestino tiene un pH elevado, lo cual es esencial para la disolución de muchas protoxinas de B. thuringiensis. Estas son solubles solamente con pH superiores a 9,5. Las protoxinas son activadas por proteasas del intestino, las cuales llevan las protoxinas de 130 kDa a una toxina de 55-65 k Da, resistente a proteasa y que comprende la región N terminal de la protoxina.

La especificidad de la delta endotoxina a un tipo de insecto en particular implica la presencia de receptores específicos, la toxina se inserta de forma irreversible a la membrana plasmática de las células intestinales y el próximo paso es la formación de un poro o lesión en esta membrana que conduce a una variación en su permeabilidad, alterando el transporte de los iones de potasio, lo cual trae como consecuencia la tisis celular, disrupción de la integridad del intestino y la muerte del insecto. Por otra parte, las esporas bacterianas se multiplican en la hemolinfa y provocan una septicemia que incrementa el efecto de las toxinas insecticidas.

En el caso de las Reta exotoxinas, éstas interfieren con las síntesis de ADN yARN y las proteínas y resultan menos específicas.

Resistencia por parte del insecto a B. thuringiensis
La habilidad de los insectos para sobreponerse y adaptarse al estrés ambiental hace que los métodos de control se vuelvan ineficientes, como sucede con el uso excesivo de algunos plaguicidas.

Hasta el momento aparecen pocos informes de resistencia a B. thuringiensis. Dos ejemplos son Plutella xylostella en repollo en Asia y Plodia interpunctella, plaga de productos almacenados. En el laboratorio se ha demostrado la posibilidad de que el insecto desarrolle resistencia al uso continuado de B. thuringiensis, sobre todo a las delta endotoxinas, porque para la beta exotoxinas el efecto es mucho menor.

Es importante señalar que los resultados de laboratorio no pueden extrapolarse a las condiciones de campo, porque las condiciones ambientales y la presión de selección natural juegan un papel importante.

La resistencia por parte del insecto a B. thuringiensis se explica por vía bioquímica, fisiológica y de conducta. En el primer caso, el insecto llega a metabolizar las toxinas, en el segundo parece existir una disminución de sensibilidad en los receptores y en el tercero disminuye la habilidad del insecto para aceptar el insecticida.

Se han desarrollado diferentes estrategias para disminuir la posible resistencia a esta bacteria. Una de las más utilizadas es su uso en programas de manejo integrado. Otra estrategia es el uso de productos a partir de diferentes cepas de B. thuringiensis, con diferentes tipos de deltaendotoxinas.
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¹Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal Playa, C. Habana Cuba. oflarrea@inisav.cu