INFORMACIÓN TÉCNICA

Producción de B. thuringiensis
En biotecnología son utilizados dos tipos de producciones básicas: cultivos superficiales sobre medios sólidos o semisólidos y producción en medios líquidos superficiales o sumergidos.

Uno de los aspectos más importantes de B. thuringiensis es su producción a escala industrial. La primer etapa, la cual es una de las más importantes de este proceso, es la selección y conservación de las cepas de trabajo. En muchos países se desarrollan programas de prospección de nuevos aislamientos de la bacteria para ampliar su espectro y aumentar su capacidad insecticida.

El mantenimiento y conservación de las cepas seleccionadas es una garantía del éxito del proceso y del producto final. Para la conservación se emplean diferentes métodos, entre los más utilizados están la liofilización, suelo estéril, papel de filtro, medio agarizado, etc. Lo más importante es evitar los subcultivos continuos, porque se puede perder la virulencia y podrían aparecer poblaciones acristalíferas.

El desarrollo del producto a partir de la cepa seleccionada comienza con la preparación de los inóculos, los cuales se obtienen generalmente en zarandas mediante cultivos líquidos agitados ya partir de éstos se realizan lo 2 subcultivos en fermentadores de menor volumen, dependiendo de la magnitud del volumen final de trabajo. Se recomienda que los inóculos tengan una concentración inicial de 106 células /ml.

Pueden utilizarse cultivos totalmente esporulados o en fase de crecimiento exponencial, pero no es recomendable utilizar otros instares porque los cultivos obtenidos no serían homogéneos.

La composición del medio de cultivo es muy importante porque es necesario ajustar el balance de los nutrimentos, principalmente carbono y nitrógeno para obtener una concentración elevada de biomasa bacteriana y una buena cantidad de cristales tóxicos. Otros nutrimentos también son importantes, tales como las sales de magnesio, manganeso, carbonatos y fosfatos.

Como fuentes nitrogenadas se utilizan harinas de soya, maíz, trigo y pescado entre otras y como fuentes de carbono se emplean principalmente almidones y en ocasiones melazas.

El valor de pH es un parámetro importante y aunque generalmente se deja libre durante el proceso, es necesario ajustar los medios de cultivo para que no sea menor a 5,0. En general, el pH inicial debe ser de 6,8-7,2, pero baja después de las primeras 8-12 h, hasta llegar a 5,0. Posteriormente, se incrementa lentamente y al final el proceso tiene un valor aproximado de 8,0. Esta cinética es un buen indicador del proceso.

Durante el proceso de producción de B. thuringiensis es importante considerar el suministro de oxígeno porque esta bacteria requiere un elevado nivel de este gas, en especial durante la fase de crecimiento exponencial. Esta demanda disminuye durante la esporogénesis y en la etapa de lisis del esporangio y liberación de la delta endotoxina. Esto permite disminuir el suministro de aire en la etapa final de la producción, lo que representa una economía en el proceso.

Cuando se eleva el suministro de oxígeno y dado que se utilizan medios de cultivo ricos en proteínas, existe el riesgo de que se produzca un exceso de espuma; por lo cual es necesario, en ocasiones, adicionar antiespumantes. Esto debe hacerse con cuidado y el antiespumante seleccionado no debe afectar el desarrollo de la bacteria. Además un exceso de este producto puede crear una anaerobiosis parcial con detrimento de la calidad del proceso. También puede ocasionar problemas durante el recobrado y la formulación.

Los procesos industriales se realizan en grandes ferrnentadores y el recobrado mediante procesos de sedimentación, filtración o centrifugación, este último es el más eficiente.

Producción sólida de B. thuringiensis
Husz en 1931 utilizó un medio sólido y métodos estándares de laboratorio, mezclando esporas de B. thuringiensis de 224 cajas de Petri con 6 kg de talco para la producción de polvos. Steinhaus y Hall en 1951 y 1954 produjeron B. thuringiensis en cajas con agar. Actualmente, se desarrollan los métodos de producción por cultivo sumergido, los cuales son más eficientes, económicos, permiten la producción a mayor escala, con menos contaminación y mejor control de la calidad.

En China, la producción por cultivo sumergido se realiza en forma industrial y sobre sustratos sólidos a pequeña escalas, en forma artesanal. También utilizan bandejas o frascos con medios líquidos en condiciones de cultivo estático.

B. thuringiensis es producido en forma sólida, semisólida y por cultivo sumergido o líquido estático; sin embargo, la producción a escala comercial se realiza por fermentación sumergida en grandes tanques que contienen medio de cultivo.

En los medios semisólidos, la humedad debe controlarse muy bien para asegurar el desarrollo del microorganismo sin provocar agregación de las partículas y con una adecuada transferencia de oxígeno. La producción semisólida de esta bacteria en China permite obtener cantidades importantes del microorganismo, pero con menor eficiencia que por cultivo sumergido y sólo a escalas limitadas de producción. Otro de los aspectos negativos es la esterilidad durante el proceso de producción. Mantener condiciones uniformes durante el proceso y ajustar parámetros como el pH y la temperatura resultan difíciles en los me- dios sólidos y semisólidos. Por tanto, se considera que el mejor método de producción es el cultivo sumergido.

Formulaciones y limitaciones de uso de B. thuringiensis
Los tipos de formulaciones de esta bacteria son polvos humedecibles, polvos secos, granulados o emulsiones. Las formas secas son más estables durante su almacenamiento, mientras que las líquidas resultan más económicas.

A pesar de las ventajas de los productos de B. thuringiensis, éstos también presentan algunas limitaciones como: poca persistencia en el campo, no llega a todos los nichos ecológicos y el insecto puede desarrollar resistencia.

No obstante, estos problemas pueden solucionarse mediante formulaciones más estables, el uso de cepas recombinantes y mejorar las estrategias de aplicación.

Mercado
Se considera que más del 90% de los productos biológicos utilizados actualmente en la agricultura son B. thuringiensis. Las ventas de estos productos en el año 2000 fueron de casi US$ 200 millones. Algunos de los productos de B. thuringiensis son: Bitoxibacillín, Eksotoxin, Agritol, Bactospeine, Bathurin, Biospor, Dipel, Javelin, Sporeine.

En algunos países, el acceso a estos productos es aún limitado para los pequeños agricultores sobre todo por el costo elevado del producto y la falta de información sobre sus potencialidades y ventajas.

Producción de B. thuringiensis en Cuba
Este entomopatógeno se produce utilizando tres métodos: cultivos líquidos estáticos, sobre sustratos sólidos y por cultivo sumergido. Los primeros se obtienen en laboratorios llamados CREE (Centros de Reproducción de Entomófagos y Entomopatógenos), distribuidos en todo el país.

El proceso sobre cultivo líquido estático consiste en cultivar la bacteria en medios líquidos compuestos por subproductos agrícolas o industriales, principalmente de la industria azucarera. La composición de los medios puede variar y generalmente se adapta a las posibilidades de la región donde se ubica el Centro Productor. Se emplean frascos de cristal y se agrega al medio de cultivo en una relación 1:5. Después de esterilizados e inoculados, se mantienen en reposo a 28-30 °C durante 10-15 días, dependiendo de la cepa y del medio de cultivo utilizado. Transcurrido este tiempo, se cosecha el producto y se le agrega un preservante que permite su almacenamiento hasta por tres meses, a temperaturas no superiores a 25 °C. Con esta producción se obtienen concentraciones de esporas y cristales de 108 /ml. Su costo de producción es de US$2-3/L.

La producción sobre sus trato sólido usando arroz es otra alternativa artesanal de producción de B. thuringiensis. Este proceso tiene una primera fase de propagación de la bacteria en un medio líquido compuesto por diferentes nutrimentos y sales. Una vez desarrollado el cultivo inicial, en condiciones estáticas o en zaranda hasta la fase de esporulación, éste se utiliza para inocular el arroz previamente esterilizado y distribuido en los frascos de reproducción. Durante esta etapa se debe ajustar la humedad a un nivel que permita el desarrollo de la bacteria. Al inocular, además de las esporas y cristales se incluyen residuos del medio de cultivo del inóculo que no fueron totalmente agotados durante la primera etapa de propagación y que favorecen el desarrollo de la bacteria sobre el sustrato sólido. La incubación después de 5-7 días permite la nueva propagación de la bacteria hasta la formación de esporas y cristales. En esta etapa se realiza la cosecha y se mantiene durante 48-72 horas en un cuarto a menos de 20 °C y un deshumificador para eliminar la humedad residual del producto. Una vez seco, el producto se envasa en bolsas plástica y se almacena durante 3 meses a 20-25 °C. Para utilizarlo es necesario resuspender los granos de arroz en agua y filtrar por una malla o tamiz.

El otro método usado en Cuba para reproducir B. thuringiensis es el industrial y se realiza en tres plantas de fermentación ubicadas en el occidente y centro del país. Por este proceso se obtienen productos con- centrados por sedimentación. El proceso tarda entre 72 y 96 horas, los productos alcanzan concentraciones de esporas y cristales de 4-6 x109 equivalente a 18000- 22000 UI(m), y es posible almacenarlos durante 6 meses a temperatura ambiente, inferior a 28 °C. Su costo de producción es de aproximadamente US$ 2-3/ producto concentrado.

Actualmente en Cuba, se obtienen cuatro líneas de productos de B. thuringiensis bajo el nombre genérico de thurisav, con los cuales se controlan diferentes plagas de lepidópteros en cultivos de importancia económica. También se produce un producto eficaz para el control de diferentes especies de ácaros plagas como el ácaro rojo de plátano y el ácaro del moho de los cítricos.

El control de la calidad de los productos se realiza mediante la aplicación de normas y programas, que garantizan la obtención de productos de calidad establecida.

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